VHP滅菌的步驟如下。
①準備工作。將干燥箱冷阱中的水分清除干凈，使內部表面干燥，且溫度均一，測量擱板、箱壁、冷阱盤管等處溫度均在允許范圍內（滅菌有效溫度為4~80℃），測試凍干機與蒸氣發生器間無泄漏，凍干機在真空下能維持一段時間真空度沒有明顯下降。
②滅菌。將凍干機抽到250Pa以下，將30%的雙氧水放入發生器，雙氧水在發生器內氣化后通入干燥箱和冷阱，維持一定時間后放人無菌空氣并排氣。這樣重復數次。
③滅菌結束后，通人無菌空氣，用水環泵將空氣排出，直至排氣中含雙氧水的質量分數在0.0001%以下。若用油封泵則應在泵前加裝觸媒板，使雙氧水分解成水和氧。
④檢驗。一般采用生物指示劑檢查滅菌效果，即用耐熱板培養耐熱桿菌孢子，每1cm2板上培養105個孢子的凍干品，將其懸掛于擬檢驗處，箱阱用VHP滅菌后，將其取出放人培養液中培養24小時到7天，檢驗凍干機該處是否已完全滅菌。
